1845년 프로이센의 레네프에서 직물업자의 외아들로 출생했다. 1848년에 가족에 네덜란드로 이사하였고, 사립학교를 거쳐 위트레흐트 기술학교에 진학하였다. 그러나 그는 학교 선생의 초상을 그린 친구를 밀고하지 않아 퇴학당하고 대학 입학 자격을 박탈당했다. 대신 취리히 연방 기술전문학교 기계공학과에 입학하였고, 1869년 취리히 대학에서 박사학위를 취득했다.

1874년 스트라스부르 대학에서 강사가 되었고, 1875년 호엔하임 농업학교의 교수가 되었다가 다시 1876년 스트라스부르 대학의 물리학 교수가 되었다.

1879년 기센 대학 물리학과장을 거쳐 1888년 뷔르츠부르크 대학의 물리학 연구소장이 되었다. 1895년 뢴트겐은 각종 진공관 시험에서 전하가 방전되는 작용을 관찰하고 있었는데, 음극선이 형광작용을 하는 것을 발견하였다. 이에 따라 마분지 덮개로 진공관을 덮고 실험하여 발광현상을 수차례 관찰하였으며, 이에 대한 실험을 거쳐 발견한 새로운 광선을 X선이라고 명명하였다. 빛과는 무관한 것으로 생각하여 성질을 모른다는 뜻으로 X라 명명한 것이다. 그는 X선의 발견 이후 아내의 손을 X선으로 찍었는데, 뼈가 드러난 모습과 약지의 반지까지 선명하게 찍혔다.

뢴트겐은 연구성과를 취합하여 1895년 논문 ＜새 종류의 광선에 대하여＞를 발표하였으며, 뷔르츠부르크 대학에서 명예 의학박사 학위를 받았다. 1900년 뮌헨 대학으로 옮겼으며 1901년에는 최초로 노벨 물리학상을 수상했는데, 그의 대학에 상금을 기부했다. 또한 X선에 대한 특허권을 갖고자 하지 않았다. 대신 그의 사후인 2004년 111번째 화학원소가 그의 이름을 따서 뢴트게늄으로 명명되었다.

뢴트겐은 X선 외에 비열과 열전도, 전자기장, 전류, 탄성 등을 연구했다. 1923년 악성 종양으로 사망하였으나 방사선 실험 때문으로는 추정되지 않는다.

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